据南京巴傲得生物科技有限公司2013年9月26日12:00最新数据分析：质粒构建细胞制备方法有哪些?南京巴傲得专家来为您总结。巴傲得生物科技有限公司是专业从事专业IHC试剂盒、、最先进的蛋白表达、权威机构、proteinA产品。等生命科学研究的专业技术型企业。从事生物技术产品的开发及销售，致力于将巴傲得生物打造成中国乃至世界一流的生物技术产品供应商。咨询热线：***
质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA转化带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达.
目前常用的感受态细胞制备方法有电击法和CaCl2法, 电击法制备效率较高,但CaCl2法简单易行,且其转化效率可以满足一般的实验要求,因此CaCl2法使用更为广泛. CaCl2法制备感受态大肠杆菌的方法步骤:
准备
（1）配制0.05mol/l的CaCl2-15％的甘油混合溶液,高温高压灭菌. 注: CaCl2必须为分析纯以上,
（2）实验中所需要的所有试管、培养瓶、离心管等均要用去离子水彻底清洗干净,高温高压灭菌. 注:最好有用于制备感受态细胞的一套专用器材.
(3）受体菌的培养:从非选择性LB培养基上挑取***单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜至对数生长期中后期.将该菌悬液以1:100的比例接种于50-100ml LB培养基中, 37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5. 注:培养时间不宜超过2.5小时,否则不能达到最高转化效率.
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