据南京巴傲得生物科技有限公司2013年9月13日12:00最新数据分析:南京巴傲得质粒构建生物专家为您专业定制质粒构建。巴傲得生物科技有限公司是专业从事专业IHC试剂盒、、最先进的蛋白表达、、proteinA产品。等生命科学研究的专业技术型企业。从事生物技术产品的开发及销售,致力于将巴傲得生物打造成中国乃至世界一流的生物技术产品供应商。咨询热线:***
质粒构建反应的基本原理和操作技术,了解引物设计的基本要求。
实验原理:外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术,这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中,将转化后的细胞在选择性培养基中培养,可以通过α互补筛选法筛选出重组子,并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱,选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点,否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法,即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段,酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端,再选用同样的限制性内切酶处理载体。在构建重组子时,除了形成正常的重组子外,还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中,或目的DNA串联后再插入载体分子中,甚至出现载体分子自连,重新环化的现象。单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有去最佳反应件,最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成,在双酶切体系中,限制性内切酶在使用时应遵循。
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